O jogo se inicia logo depois dos eventos de Assassin's Creed II, no ano de 1499, quando Monteriggioni (ou a Villa Auditore) é atacada pelo exército Borgia, comandado por Cesare Borgia. Durante a batalha, o tio de Ezio, Mario, é morto e a Maçã do Éden é roubada. O jogo então avança até o ano de 1503, onde Ezio Auditore, agora um Mestre Assassino, deve procurar, nas ruas de Roma, pelos assassinos de seu tio e recuperar a Maçã do Éden, item tão importante para a Seita dos Assassinos.
A Terceiro game da franquia de Assassin's Creed, desenvolvido pela Ubisoft para Microsoft Windows (PC), PlayStation 3 e Xbox 360, com a data de lançamento marcada para 16 Novembro de 2010. Será o primeiro jogo da série a apresentar um modo multiplayer.
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